说明书下载中心：高纯度质粒小提试剂盒
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货号： |
SB-NG201S |
100次 |
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SB-NG201M |
200次 |
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试剂盒组成 |
保存 |
100次 |
200次 |
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RNaseA（10mg/ml） |
-20℃ |
250µl |
500µl |
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溶液S1 |
4℃ |
25 ml |
50 ml |
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溶液S2 |
室温 |
25 ml |
50 ml |
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溶液S3 |
室温 |
40 ml |
80 ml |
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漂洗液PE |
室温 |
50ml |
100 ml |
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漂洗液WB |
室温 |
25ml |
50ml |
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加4倍体积无水乙醇 |
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洗脱缓冲液EB |
室温 |
15ml |
20ml |
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吸附柱AC |
室温 |
100个 |
200个 |
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收集管（2ml） |
室温 |
100个 |
200个 |
储存事项:
- 第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液S1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液S1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液S1中补加RNase A即可。
- 环境温度低时溶液S2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：
本品采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
- 独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
- 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
注意事项
- 所有的离心步骤均在室温完成，离心机转速需达到13,000rpm。
- 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加S1、S2、S3的用量，其它步骤相同。
- 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
- 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
- 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
- 第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
- 将RNase A全部加入溶液S1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。
- 取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。
收集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
- 用250μl溶液S1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
- 加250μl的溶液S2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
- 加350μl溶液S3，立即温和地上下翻转6 -8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，小心取上清。
加入溶液S3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
- 将上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
- 可选步骤:加入500μl去蛋白液PE，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。
- 加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
- 加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
- 将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
