产品规格 说明书下载链接：Alpaca anti–GFP VHH Magnetic Beads
货号：SB-NM001
规格：500uL（20 次，50%nanobody coated magarose beads）
储存条件： 4℃（禁止冻存）
保质期：6 个月
运输：冰袋运输
产品说明
GFP- 磁珠由绿色荧光蛋白纳米抗体组成,共价结合到磁珠上。GFP-磁珠用于免疫共沉淀来自哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等多种生物的细胞提取物中的荧光蛋白。
产品属性
珠子规格：30-100um
储存缓冲液：1XPBS、防腐剂 0.03%NaN3
结合能力：每 10ul 磁珠结合 3-4ug GFP
配体：抗 gfp 单域抗体（vhh、nanobody）
反应性：与最常见的绿色荧光蛋白及其衍生物结合
l 推荐使用溶液
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Buffer |
Composition |
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Lysis buffer（CoIP） |
10mM Tris-HCl pH7.5;150mM NaCl;0.5mM EDTA;0.5% NP-40 |
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RIPA buffer |
10mM Tris-HCl pH7.5;150mM NaCl;0.5mME DTA;0.1%SDS;1% Triton |
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X-100;1% Deoxycholate |
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Dilution/Wash buffer |
10mM Tris-HCl pH7.5;150mM NaCl;0.5mM EDTA; |
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2×SDS loading buffer |
120mM Tris-HCl pH6.8;20% glycerol;4%SDS,0.04% Bromophenol |
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blue;10% β-mercaptoehanol |
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Glycine-elution buffer |
200 mM glycine pH 2.5 |
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Neutralization buffer |
1 M Tris pH 10.4 |
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注意：对于其他细胞类型，如酵母、植物、昆虫、细菌，请使用等效的细胞溶解缓冲液
操作说明
- 收集细胞：
对于一个免疫共沉淀反应，推荐使用 106-107 个表达 GFP 融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出培养液，加 1ml 预冷 1XPBS 于细胞中并刮下细胞，之后将细胞转入预冷的离心管中，4℃，800G 离心 3 分钟，弃上清液，用预冷 1XPBS 洗两次细胞沉淀物，轻轻重悬细胞。
- 裂解细胞
- 对于细胞质蛋白，用 200μL 预冷 Lysis buffer 重悬细胞
注：在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和 1mM PMSF 。
对于核蛋白可选做：加入 1mg/mL DNase、2.5mM MgCl2、蛋白酶抑制剂 RIPA buffer 和 1mM PMSF
- 将离心管放在冰上 30 分钟，每隔 10 分钟重悬细胞一次。
- 4℃、16000g 离心 10 分钟，将上清液转移到一个新的预冷离心管中，加入 300μL
dilution buffer，丢掉沉淀。 如果需要，保存 50uL 裂解液进行进一步分析。
注：此步骤获得的细胞溶解物可置于-80℃下长期保存。
可选做：在稀释液中加入 1mM PMSF 和蛋白酶抑制剂。
- 平衡磁珠：
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- 吸取 35uL 纯磁珠(70ul 混悬液）放在 1.5ml 离心管中
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- 加入 1ml 预冷 1xPBST,手拿上下晃动 60 秒，不要太剧烈
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- 放入磁力架静置分离磁珠 60 秒，直到上清液澄清，丢掉上清液，重复 3 次
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- 结合蛋白
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- 在平衡好的磁珠中加入细胞裂解液 500ul
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- 在 4℃用 翻转摇床旋转 1 小时
- 洗涤
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- 用磁力架静置分离磁珠，直到上清液澄清，丢弃上清液。（如果需要，保存 50uL 上清液以供进一步分析）
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- 再加 1ml 预冷 1xPBST 悬浮磁珠
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- 磁力架静置分离磁珠，丢弃上清液，重复此步骤至少 4 次
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- 洗脱结合蛋白
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- 除去剩余的上清液
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- 用 40uL 1XSDS 样品缓冲液悬浮磁珠
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- 将磁珠在 95°C 中加热 10 分钟，使免疫复合物与磁珠分离
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- 用磁力架静置分离磁珠并在 SDS-PAGE 中分析上清液
- 甘氨酸洗脱缓冲液洗脱（可替代步骤 6）
- 除去剩余的上清液
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- 加入 70uL 甘氨酸洗脱缓冲液，并在 4°C 保存混匀 10 分钟
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- 用磁力架静置分离磁珠，把上清部分转移到新的离心管里
立即用 35uL 中和缓冲液中和洗脱液部分
